CyDye mono-reactive NHS Esters (菁染料琥珀酰亞胺酯)

1.產品簡介：

   菁染料是性能優良的熒光標記染料，摩爾吸光系數在熒光染料中是最gao的，其琥珀酰亞胺 酯是最chang用的脂 肪氨基標記試劑，廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標記和檢測。 通過改變次甲基鏈的長度，可改 變其熒光發射波長，每增加一個雙鍵，按照Huoffman 規則正 好紅移約 100nm。 菁染料 Cy3 和 Cy5 已成為基因芯片的首xuan熒光標記物；另外,Cy5, Cy5.5 和 Cy7 的吸收在近紅外區背 景非常 低，是熒光強度最gao、最wen定的長波長染料。特別適合于活體小動物體內成像代替放射性元素。但 由于菁染 料，尤其是不對稱菁染料的合成副反應多，副產物極性相近，產物的分離提純相當困難。菁染料 特別是水溶性菁 染料分子極性大，分離提純越加困難。

 表 1.菁染料琥珀酰亞胺酯的性質參數

2. 操作步驟

2.1水溶性Cy3 NHS標記anti-GST多克隆抗體

市場上買到的抗體如果含有其它蛋白(例如serum albumin或gelatin等)或帶氨基的緩沖液會影響標記, 在標記前需純化。

1.在1 L 0.15 M NaCI溶液中透析anti-GST抗體(濃度為0.5 mL at 3 mg/mL),常溫透析4小時。

2.在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCI溶液再透析過夜。

3.第二天用1 L 0.1 M NaHCOs (pH 8.3)透析4小時。

4.用0.22卩m注射器過濾頭過濾抗體溶液。

5.用0.1 M NaHCOs稀釋少量的抗體，在280nm處測其紫外吸收值計算標記抗體的總量(IgG antibody摩爾吸光系數170 000 cm" at 280 nm).

6.用DMS。配置Cy3 NHS(MW 765.95)溶液濃度為10 mg/mL；計算所需體積以得到想要的CyDye NHS和抗體的比值(例如20:1),然后慢慢'壽其入到抗體溶液中，同時在暗處常溫緩慢攪 拌 45 分鐘。

7.用1 L 0.15 M NaCI 溶液常溫避光透析4小時除去未標記上的Cy3。

8.在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCI溶液再避光透析過夜。

9.用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01%疊氮hua鈉溶液常溫避光透析4小時，在4°C常溫避光再次透析過夜。

10.用0.22卩m注射器過濾頭過濾抗體溶液。

11.用0.01 M PBS/0.01 %疊氮hua鈉整數倍稀釋標記抗體溶液，測量280nm (蛋白)和552nm (Cy)處的紫外可見吸光度。

12,產品冷凍干燥成粉末或在0.01 M PBS/ 0.01%疊氮hua鈉溶液中，-20°C避光儲存。

2.2 水溶性 Cy5 NHS 標記

1.Cy5 NHS 1.0 mg溶解于400 pL DMS。后，加入到1mL的玻璃瓶中盛有(D-seQ-leucine-enkephalin acetate (YSGFLT, 0.75 mg)的400 pL DMS。溶液。(Dye和peptide投料比是1:1)

2.然后加入15卩L三乙胺，常溫避光攪拌反應混合物過夜。

3.用HPLC純化蛋白，使用蛋白C18柱子(25cmx10mm),每次上樣注入2x400卩L, 30分鐘梯度洗脫從0.1% TFA水溶液到MeCN：HQ (0.1% TFA) =70：30,流速4mL/min°(對不同的蛋白選擇不同的合適HPL C梯度流動相)

4.收集適當的色帶峰，標記多肽的保留時間比未標記的多肽長。

5.產品冷凍干燥成粉末或在水溶液中，-20°C避光儲存；必要肘可用質譜表征。

6.CyDye標記的蛋白穩定性取決于蛋白本身。例如標記的IgG在4 ℃可避光保存2月；更長期的保存需加入等體積的甘油-20 °C避光保存。

2.3 水溶性 CyDye SE 標記

         氨基封端的OLIGO可以標記CyDyeSE,但是非常困難；標記前因為OILGO經氨水脫保護， 請務必洗滌掉 所有的殘余氨水。然后將樣品真空干燥；然后溶于0.25 ml的0.5 M NaCI溶液中，用Sephadex G-50 脫 鹽，用5.0 mM borate緩沖液平衡到pH=8.0,然后用以上硼酸緩沖液 沖下 OLIGO。然后濃縮至干的樣品溶于0.1 M carbonate buffer (pH 8.5-9.0)；在0.5mL碳酸緩沖液中30 nmoles的。LIGO加入到CyDye SE的玻璃 瓶中室溫避光，密閉攪拌反應60min。 反應物經Sephadex G-50或RP-HPLC過柱純化，冷凍干燥后避光保存。

注意：Oligonucleotides 和 oligopeptides 由于太小會留在過濾膜上或在凍存管內貼壁成膜，無法標記。

2.4 活體成像領域

SPF級BALB/C裸鼠，6-8周齡，18-20克，實驗前24 h自由進食、飲水。

于實驗裸鼠腹腔內注射2%戊babi妥鈉300^(215 mg/ kg)麻醉動物。將裸鼠俯臥位平放于小動物多光譜活 體成像系統的記錄暗箱中。實驗時將Cy7或Cy7標記的生物分子或藥物DMSO稀釋后，于裸鼠尾靜脈注射200pL( 0.5 mg/g)［最jia用量和時間需要客戶根據自己的儀器和藥 物試劑等條件優化］，每5min記錄1張動物 在體內發射熒光的成像圖片，分析熒光藥物的分 布情況。對照鼠不注射藥物，進行同時記錄。記錄結束后迅速 解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、腎 等臟器，進行成像。

 Cy7 檢測時激發波長700?770 nm帶通，發射波長790 nm長通。液晶可調諧濾光片掃描 范圍780?950 nm，掃描步進 10 nm。曝光時間為500 ms。

不同的藥物代謝時間不一樣，注射入裸鼠體內，熒光立即分布全身，然后逐歩向膀胱聚集， 呈現顯著的腎 排泄的特點一般 4~6 小時，快得只有30分鐘；如果是骨骼等部位靶尋的Cy7標 記藥物，有客戶反映一周后活體成像系統仍能檢測到熒光成像。

器官切片觀察：將解剖的器官迅速放置于4%多聚甲醪也不4小時以上，0%, 20%, 30%PBS蔗糖依次沉底,20卩m切片，多聚賴氨酸洗過的載玻片貼片，B応干，DAP'染色。共聚焦顯微鏡觀察，激光器為氨氤633 nm。

穩定性與儲存：

  未幵封的粉末在避光干燥-20°C存放12月。CyDye NHS水溶液現配現用不能儲存。任何溶解后的CyDye NHS粉末最hao立即使用；無水h；DMSO瞥/- 20°C保存最duo2個星期。

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