【干貨分享】Western實驗步驟及產品選擇

Western blot，也稱Western blotting、Western印跡，常簡寫為WB，是用抗體檢測蛋白表達的重要方法之一。WB步驟操作如下：

一、 收集蛋白樣品(Protein sample preparation)

1、裂解液的選擇

根據蛋白在細胞中的位置選擇合適的裂解液，例如RIPA強(R1091)用于核蛋白及膜蛋白的提取、RIPA中（R1090）用于胞漿蛋白的提取、而RIPA弱或者western專用裂解液（W0013）適用于較好提取的蛋白；

對于某些特定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進行抽提

2、抑制蛋白降解

為防止蛋白的降解，需要添加蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑等。例如LABLEAD的蛋白酶抑制劑cocktail（C0101）是一種廣譜型的抑制劑，由六種成分配置成的溶液，可適用于蛋白純化，western，IP等各種實驗。

如研究磷酸化蛋白，為保持蛋白的穩定，可使用磷酸蛋白酶酶抑制劑（C0104）。

3、蛋白定量：

收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據所使用的裂解液的不同，需要采用適當的蛋白濃度測定方法。不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。

如果使用LABLEAD的裂解液(R1091、R1090、W0013)，可使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(B5001)、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)(B5106)。

如自己配置裂解液，其中含有triton x-100、SDS等去污劑時，推薦使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(B5001)；如溶液中含有EDTA、DTT等還原劑時推薦使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒（B5105）

二、電泳(Electrophoresis)

1、SDS-PAGE凝膠配制

SDS-PAGE凝膠分幾種配置的方式，如需自行配置可購買制膠液，如30%制膠液（A3291）、4*SDS濃縮膠緩沖液（S4880）、4*SDS分離膠緩沖液（S4680），也可使用LABLEAD生產的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(P1050M)、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(P0105)。兩種試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。

如需更方便的電泳，可使用LABLEAD的各種濃度規格的預制膠產品(P00812/P00815/P01012/P01015/P01212/P01215/P41212/P41215/P42012/P42015)。

2、樣品處理

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如4X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關文獻資料配制，推薦LABLEAD的蛋白上樣緩沖液(4X)(G2526)或 蛋白上樣緩沖液(5X) (G2527)。

如果是非變性樣品，可以使用非變性非還原性蛋白上樣緩沖液(G2621)。

樣品處理時可按照100℃或沸水浴加熱3-5min，或者95℃ 加熱10min，以充分變性蛋白。如使用預制膠，可適當延長樣品處理的時間。

3、上樣與電泳

蛋白樣品冷卻到室溫后，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。

LABLEAD提供各種預染蛋白質分子量標準用于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小。最好使用彩色預染蛋白質分子量標準(P1017/P1018/P1025/P10310)。

電泳液推薦使用蘭博利德生產的SDS-PAGE電泳液(T7777)，或者可以長期儲存的速溶顆粒產品（T7206M）。

電泳時推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，當溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標準電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設置在80-100V，高電壓可以設置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。為了方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設置在100V，然后設定定時時間為90-120分鐘。設置定時可避免發生電泳過頭的情況。

當溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或可根據預染蛋白質分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經被適當分離后即可停止電泳。

三、 轉膜(Transfer)

推薦在Western實驗中選用PVDF膜，優先推薦使用PVDF膜，如蛋白分子量大于20KD推薦使用(進口分裝，13.25*15cm,0.45μm) (IPVH00010-1)，蛋白分子量小于20KD推薦使用(進口分裝，13.25*15cm,0.45μm) (ISEQ00010-1)。PVDF膜在使用前須經甲醇浸潤和活化。也可使用硝酸纖維素膜(NC膜)，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。

轉膜推薦使用bio-rad的預裁轉印濾紙(7.5×10cm) (cat：1703932)，吸水性強，不掉屑。

轉膜溶液推薦使用LABLEAD的10X轉膜緩沖液(T3011)，需要在稀釋是添加20%的甲醇，以提高轉膜效率。出于安全性、省事性的考慮LABLEAD還有使用乙醇配置的轉膜緩沖液，20x快速轉膜緩沖液（T3012）

通常濕式轉膜方式，可以設定轉膜電流為300-400mA，轉膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉膜過夜。具體的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時間越短。

如使用伯樂的Turbo系統進行半干轉時，在使用伯樂配套的轉膜緩沖液（）時，則可參考以下轉膜條件：2.5A恒流，限壓25V，3-5min即可完成轉膜。

在轉膜過程中，特別是高電流快速轉膜時，通常會有非常嚴重的發熱現象，最好把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。

轉膜的效果可參考所使用的預染蛋白質分子量標準，其中分子量最大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗春紅染色液對膜進行染色，用于觀察實際的轉膜效果。也可用免脫色考馬斯亮藍快速染色液(G1042)對完成轉膜的蛋白膠進行染色，用于檢測轉膜的效果。

四、封閉(Blocking)

轉膜結束后，將蛋白膜放置到預先加入了清水的孵育盒（FYH01-1）中，漂洗1-2分鐘，洗去膜上的轉膜液。轉膜結束后的所有步驟，要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則很容易產生較高的背景。

倒掉洗膜后的液體，推薦加入適量的快速封閉液(P0203)，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉20-30分鐘；也可以加入用脫脂奶粉（N7861）配置的5%的溶液作為封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60分鐘或者4度過夜。對于一些背景較高的抗體，兩種封閉液都可以適當延長封閉時間，如有必要甚至可以4℃封閉過夜。

五、一抗孵育(Primary antibody incubation)

參考一抗的說明書，按照適當比例用一抗稀釋液(D0151)稀釋一抗。一抗也可以用TBST溶液或者配置好的封閉液稀釋，但是為了延長一抗的使用時間，推薦用一抗稀釋液。

收集封閉液，然后加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育過夜。也可根據抗體的說明選擇適當的孵育溫度和時間。

回收一抗。加入TBST緩沖液(T9039)洗去未結合的一抗，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

Western結果通常需要提供內參作為對照，可以選用Tubulin抗體(T0100)、Actin抗體(A0101)或GAPDH抗體(G0100)，進行內參檢測。

六、二抗孵育(Secondary antibody incubation)

參考二抗的說明書選擇辣根過氧化物酶(HRP)等標記的二抗。二抗需根據一抗進行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如山羊抗小鼠IgG-HRP(H+L)(S0100)。

加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。

回收二抗，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘，重復洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

七、顯影檢測

使用LABLEAD ECL發光液來檢測蛋白，ECL發光液 普通款（E1050）一般使用暗室曝光時可推薦此款。如需更靈敏的發光液，推薦使用 ECL 超敏發光液（E1060），和 ECL 超敏發光液M（E1070，和millipore WBKLS0100同級別）；如蛋白豐度極低時推薦使用 ECL超敏發光液(femto)（E1080）。

八、膜的重復利用

如果蛋白樣品很寶貴，可使用膜再生液(M0500)處理蛋白膜，以重復利用蛋白膜。再次重生使用的膜需要重新封閉后孵育新的二抗。