T7 High Yield RNA Synthesis Kit

產品貨號 ：T0126

儲存條件： -20℃ 保存，有效期2年

產品描述

產品簡介

T7 High Yield RNA Synthesis Kit是一種使用T7 RNA聚合酶，以帶有T7啟動子的DNA為模板，通過體外轉錄大量合成RNA的試劑盒，適用于長鏈和短鏈轉錄本。本品提供的T7 Enzyme Mix中已經預混了RNase抑制劑與無機焦磷酸酶，而DNase I，RNase-free用于轉錄反應結束后清除模板DNA。使用本品以1μg線性化雙鏈DNA模板可以轉錄獲得至少150μg以上的RNA。通過轉錄合成的RNA可用于多種下游應用，如體外翻譯、RNA結構和功能研究、RNase保護、探針雜交、RNA干擾等。

轉錄方案

使用方法

1. DNA 模板制備

帶有 T7 啟動子的線性化質粒或 PCR 擴增產物都可以作為體外轉錄模板，模板可以用TE緩沖液或Nuclease-Free Water溶解。

T7啟動子序列：TAATACGACTCACTATAN*

注：N*為RNA轉錄的第一個堿基,一般為G，若進行共轉錄由帽子類似物決定。

（1）質粒模板

將目的DNA插入含有T7啟動子的質粒載體中，然后用限制酶進行處理，待完quan線性化后進行純化。

注1：由于終止子不能保證轉錄100%終止，環狀質粒會轉錄出不同長度的RNA產物。為了得到特定長度的RNA，質粒必須完quan線性化。

注2：質粒線性化所選限制酶的酶切位點需要緊鄰編碼鏈下游，且在編碼鏈中無識別位點。選擇的限制酶要能形成5'突出末端或者平滑末端。

注3：為了避免蛋白及鹽離子等對轉錄體系的影響，線性化質粒建議純化后再作為模板進行體外轉錄。

注4：質粒DNA抽提過程中引入的RNaseA殘留會顯著影響轉錄RNA的質量，建議使用A260/A280為1.8~2.0的高純度RNase-free模板。

（2）PCR 產物模板

帶 T7 啟動子的 PCR 產物可以作為體外轉錄模板。首先將 T7 啟動 子序列加在編碼鏈上游引物的 5' 端，然后在高保真酶的作用下擴增含 T7 啟動子的 DNA模板，隨后進行轉錄。 PCR 產物可以不經純化直接作為模板， 但純化后 RNA 收率會更高。

注 1：PCR 產物作為模板，必須電泳確認產物的特異性及濃度，建議 20 μl 反應體系投入 2~5 μl PCR 產物。

注 2：為了得到更多高品質的 RNA，推薦 PCR 產物純化之后再作為模板進行體外轉錄。

2. 體外轉錄

（1）根據所需產物類型選擇下面三個反應體系進行反應溶液加樣。

①標準體外轉錄體系

在冰上配制如下反應體系：

a. 建議先加入Nuclease-Free Water, 然后再加入 ATP/CTP/GTP/UTP。

b. 可以用同樣摩爾濃度的修飾 NTP 替代相應的未修飾 NTP。

②加帽 RNA 共轉錄體系     

在冰上配制如下反應體系：

c. 帽子類似物與每種 NTP 的摩爾濃度之比應為 4 : 5，該摩爾比適用于 CleanCap 系列帽子類似物。若使用其它結構的帽子類似物，請根據帽子類似物的說明書設定帽子類似物與 GTP 的合理比例，可根據加帽效率調整比例，但兩者終濃度之和控制在 10 mM 為宜。

③非放射性標記 RNA 體外轉錄體系

d. 本體系適用生wu素修飾 UTP、熒光素修飾 UTP、地gao辛修飾 UTP 或者氨基烯丙 基修飾 UTP，使用修飾 UTP 轉錄產量會比未修飾 UTP 轉錄產量偏低。

注 1：不同模板序列的轉錄效率差異較大，初次實驗可先按照建議加入量進行，然 后再摸索優化最適體系，模板量可在 0.5 μg~2 μg的范圍進行調整。

（2）充分混勻并瞬離后，37℃溫育 2 h。若轉錄產物長度 <100 nt，可 延長反應時間至 3~16 h。

（3）反應結束后，向產物中按照每 μg Template DNA 加入 2 μl DNase I, RNase-free 的比例，37℃孵育 15 min 以去除 DNA 模板。

（4）轉錄后的 RNA 推薦用磁珠或者柱純化，也可以采用酚/氯仿或者氯化鋰純化。純化后的 RNA 可以進行下游實驗或者儲存于 -80℃備用。

3. 對照模板轉錄（T 包裝不含）

對照模板是一個含有T7啟動子的線性 DNA 片段，轉錄產物大小 約 4000 nt。在推薦的標準體外轉錄反應體系中，1μg 對照模板 DNA 在 37℃下反應 2h至少可獲得150μg以上的 RNA。

4. 產物純化

轉錄后的 RNA 可以選用磁珠法進行純化，也可以采用柱純化、酚 / 氯仿純化法或氯化鋰沉淀法等，以去除蛋白、游離的核苷酸。純化后的 RNA 經電泳檢測后可進行下游實驗或存儲于 -80℃。

(1) 磁珠純化法

按照磁珠說明書進行純化操作。

(2) 柱純化法

純化前加入80μl Nuclease-Free Water 將產物稀釋至 100 μl，再按純化柱說明書進行純化操作。

(3) 酚 / 氯仿純化法

①向 20 μl 反應混合物中，加入 115 μl Nuclease-Free Water 和 15 μl 3 M 乙酸鈉 (pH5.2)，混合均勻。

②加入等體積 (150 μl) 的酚 / 氯仿 (1：1) 混合液抽提一次，室溫以最大轉 速  (≥12000 rpm） 離心 5 min，將上層水相溶液轉移至新的 RNase-free EP 管中。

注：轉移上清時請勿吸到中間層。

③再加入等體積的氯仿抽提 2 次，收集上清，并轉移至新的 RNase-free EP 管中。

④加入 2 倍體積的無水乙醇沉淀 RNA。混合均勻后置于 -20℃至少 30 min，以最大轉速(≥12000 rpm），4℃離心 15 min，收集沉淀。

⑤加入 500 μl 冰預冷的 70% 乙醇洗滌 RNA 沉淀，以最大轉速  (≥12000 rpm） ， 4℃離心 5 min ，收集沉淀。

⑥用 20 μl Nuclease-Free Water溶解RNA 沉淀。純化后的 RNA 溶液于 -80℃保存。

(4) 氯化鋰沉淀法

采用氯化鋰沉淀法，RNA 長度至少滿足 100 nt 以上，且濃度不能低 于 100 ng/μl。

①向 20 μl 反應混合物中，加入 30 μl Nuclease-Free Water 和 30 μl 7.5 M 氯化鋰。

②混合均勻后，置于 -20℃至少 30 min，以最大轉速 (≥12000 rpm），4℃ 離心 15 min，收集沉淀。

③加入 500 μl 冰預冷的 70% 乙醇洗滌 RNA 沉淀，以

最大轉速  (≥12000 rpm），4℃離心 5 min，收集沉淀。

④用 20 μl Nuclease-Free Water 溶解 RNA 沉淀。純化后的 RNA 溶液 于 -80℃保存。

5. RNA 定量

(1) 紫外吸收法：游離的 NTP 等會嚴重影響定量的準確性，采用此方法 前請*行 RNA 純化。

(2) 染料法：可使用 RNA 特異熒光染料或相關試劑盒進行 RNA 定量，可 以對純化或者未純化的反應產物中的 RNA 進行定量。

6. RNA 檢測

(1) 凝膠電泳法

為了評估轉錄本的長度及質量，轉錄產物應選擇合適的非變性或變 性瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳檢測。變性電泳下可減少 RNA 的 二級結構形成 , 通常 RNA 以正確大小的單個條帶遷移。

注 1：電泳緩沖液和凝膠均需現配現用，使用尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時推薦 用 0.5× TBE（貨號：T7272）電泳緩沖液電泳。

注 2：轉錄完成的 RNA 可用 Nuclease-Free Water 稀釋后電泳，電泳上樣量推薦 0.05~1 μg。

注 3：加完 RNA Loading Bu?er 后的樣品可于 65℃處理 5~10 min 以減少RNA二級結構形成。

注 4：可使用 Safe Red 核酸染料 ( 貨號：CR001） 觀察 RNA 電泳條帶，聚丙烯 凝膠酰胺凝膠推薦用泡染法觀察條帶。

(2) 毛細管電泳法

毛細管電泳法可數字化的精確評估 RNA 樣本的完整性、純度或降解 程度。與凝膠法相比，此法所需 RNA 樣本量低，靈敏度高。

常見問題