2x示蹤型定量試劑盒

貨號：R0212

儲存條件：長期保存請于 -20℃避光保存，解凍后可在 4℃避光條件下穩定存放一個月，盡量避免反復凍融。

產品組分：

產品描述

2x Visual Realab Green PCR Fast mixture通用型（示蹤型定量試劑盒）是SYBR Green l嵌合染料法專用 qPCR 試劑，為2x預混液，包含除引物和 DNA 樣品以外的所有 qPCR 組分，可減少操作步驟，縮短加樣時間，降低污染幾率。其核心組分是經抗體修飾的熱啟動 Tag DNA 聚合酶，配合精心優化的 Buffer 體系以及 PCR 反應促進因子，特異性強、擴增效率高，可有效抑制非特異性擴增，對寬廣濃度范圍的模板進行準確定量，獲得穩定可靠的 qPCR結果。本品已含有通用校正染料，與絕大多數 qPCR 設備兼容，不需要額外添加染料來校正儀器。

本品可利用不同染料混合后產生的變色效應，追蹤移液過程，從而顯著減少移液錯誤。2x Visual Realab Green PCR Fast mixture通用型中包含藍色染料，10x Dilution Buffer 中包含黃色染料。當 2x Visual Realab Green PCR Fast mixture通用型(藍色)中加入了用 Dilution Buffer稀釋的模板(黃色)后會產生藍色→綠色的變色效應，從而可以根據液體顏色準確判斷是否已加入模板。

使用方法：

1. 模板稀釋

使用過程中，如需要進行移液追蹤，則根據下表選擇合適的方式提前添加 Dilution Buffer 至模板中，然后進行 qPCR 檢測;如不需要進行移液追蹤，則不使用 Dilution Buffer 即可。

建議的 qPCR 反應體系

a. 通常推薦的引物終濃度為 0.2 μM，可在 0.1~1 μM 范圍內調整；

b. 如使用 Dilution Buffer 進行加樣追蹤，模板體積請勿超出2~5μl/20 μl reaction。

如果模板用量低于 2 μl/20 μl reaction，會造成顯色偏淡，影響追蹤效果；如果模板用量高于 5 μl/20 μl reaction，Dilution Buffer 中的成分可能會干擾 qPCR 反應。不同種類 DNA 模板中含有的靶基因拷貝數目不同，必要時可進行梯度稀釋，以確定最佳的 DNA 模板添加量。

注：當模板類型為未稀釋 cDNA 原液時，不論其是否包含 1× Dilution Buffer，使用體積均不應超過 qPCR 反應總體積的 1/10，即 2 μl/20 μl reaction。

3. qPCR 反應程序（可根據機型適當調整）

兩步法

三步法

a.根據引物的 Tm 值進行退火&延伸(退火)溫度的設定;若擴增片段在 200bp 以內，退火 &延伸(延伸)時間可以設置為 15 s;此外，退火&延伸(延伸)時間的設置還需根據您使用的 qPCR 儀所需要的最短數據采集時間自行調整。

4.實驗優化

① 引物濃度調整

當引物終濃度在 0.1~1.0 μM 范圍之間變化時，引物濃度越低,擴增特異性越高，但擴增效率會有所下降。

② 擴增程序優化

需提高擴增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度;需提高擴增效率，可使用三步法程序或延長延伸時間。

5.引物設計原則

① 擴增產物長度建議控制在 80~200 bp;

② 引物長度為 18~25 bp;

③ 兩條 Tm 值相差不超過 1℃，Tm 值控制在 58~62℃;

④ 引物的 GC 含量控制在 40%~60%;

⑤ 引物 A、G、C、T 整體分布盡量要均勻，避開 T/C 或者 A/G 的連續結構(特別是 3' 端)，3' 端最后一個堿基最好為 G 或者 C;

⑥ 避開引物內部或者兩條引物之間的互補序列;

⑦ 使用 NCBI BLAST功能檢索確認引物的特異性。