BCA蛋白定量試劑盒

貨號：B5000

保存條件： BCA試劑A和B室溫保存，蛋白標準請-20℃凍存。

產品簡介：

目前世界上常用的蛋白濃度檢測方法是：BCA 蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)和 Bradford 蛋白定量試劑盒(Bradford Protein Assay Kit)。BCA 法與傳統方法相比更簡單、更穩定、更靈敏度。BCA 法測定蛋白濃度兼容性亦很好，不受大部分樣本中其他成分的影響，對于 5%以內的 SDS、Triton X-100、Tween 20、Tween 80 具有很好的兼容性,但 BCA 法測定蛋白濃度易受螯合劑、高濃度的還原劑等的影響，在 BCA 法測定蛋白濃度前應盡量使：EDTA 濃度≤10mM，DTT 濃度≤1mM，2-ME≤0.01%。

BCA Protein Assay Kit 在 50～1000μg/ml 濃度范圍內有較好的線性關系，其最小檢出量為 25μg/ml。

本試劑盒僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

產品組成：

試劑(A): BCA 試劑A      100ml

試劑(B): BCA 試劑 B      3ml

試劑(C): 蛋白標準(BSA)    20mg

試劑(D): 蛋白標準配制液   10ml

自備材料：

1、酶標儀或分光光度計

2、96 孔板或 EP 管

3、恒溫箱或水浴鍋

操作步驟(僅供參考)：

1、取 1ml 蛋白標準配制液wan全加入到含有 20mg 的蛋白標準(BSA)中，充分溶解后配制成

20mg/ml 的蛋白標準溶液，配制后可立即使用，配制的蛋白標準溶液應-20℃保存。

2、取適量的 20mg/ml 蛋白標準溶液，稀釋至終濃度為 500μg/ml 或所需濃度。如取 25μ l 蛋白標準(20mg/ml)，加入 975μl 稀釋液，充分混勻即配制成 500μg/ml 蛋白標準溶液。

注意：待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標準也宜溶解于什么樣的稀釋液中，一般可用 0.9%NaCl 或 PBS 作為溶解 BSA 稀釋液，稀釋后的 500μg/ml 蛋白標準溶液也應-20℃長期保存。

3、根據樣品數量，按試劑(A):試劑(B)=50:1 的比例配制 BCA 工作液，即取 50 份 BCA 試

劑 A 和 1 份 BCA 試劑B，充分混勻，即獲得 BCA 工作液(注意：正常 BCA 工作液應為蘋果綠或墨綠色，如變為紫色或其他顏色應棄用)。

例如:取5ml BCA 試劑 A 和0.1ml BCA 試劑 B，配制成 5.1ml BCA 工作液，BCA 工作液室溫 24 小時內穩定。

4、將 500μg/ml 蛋白標準溶液按 0、1、2、4、8、12、16、20μl 加到 96 孔板或 EP 管中， 加稀釋液補足至 20μl，其蛋白標準濃度依次為 0、25、50、100、200、300、400、500μg/ml。

5、加 20μl 待測蛋白到 96 孔板或 EP 管中，如果樣本不足 20μl，用稀釋液補足至 20μl。注意：如果標準品稀釋液與溶解待測蛋白的溶液不同，應在待測蛋白中加入 20μl 稀釋液；如果標準品稀釋液與溶解待測蛋白的溶液相同，無需在待測蛋白孔中加入 20μl 稀釋液，以減少不同溶液的差異。

6、向各孔或 EP 管加入 200μl 配制好的 BCA 工作液，37℃孵育 20～30min。

7、酶標儀或分光光度計測定 562nm 波長處吸光度(如無 562nm，540～595nm 之間的波長也可)，各孔或 EP 管吸光度減去未加 500μg/ml 蛋白標準溶液的吸光度，以求得的差值為縱坐標：以標準孔或 EP 管中蛋白濃度(μg/ml)為橫坐標，得出標準曲線及回歸方程， 根據標準曲線計算出待測樣品的蛋白濃度。

注意事項：

1、蛋白標準(BSA)粉末溶解于蛋白標準配制液后，即獲得蛋白標準原液(即 20mg/ml 的蛋白標準)，該原液中含有防腐劑，不影響后續檢測，該蛋白標準原液-20℃長期保存。

2、待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標準也宜溶解于什么樣的稀釋液中，否者待測蛋白與蛋白標準中所含非蛋白成分不一致，有可能導致測定不準確。

3、如果檢測效果不佳，可以室溫放置 2h 或 60℃放置 30min，顏色會隨著時間的延長不斷加深，顯色反應也會隨溫度升高而加快；如果濃度較低，可以適當延長孵育時間或在較高溫度下孵育。

4、測定標準曲線時發現隨著標準品濃度的增加吸光度或顏色沒有明顯變化，可能的原因是樣品中含有嚴重干擾 BCA 法測定蛋白濃度的物質。

5、BCA 法檢測時，待測樣本中不應含有EGTA，否則影響檢測結果。

6、因 BCA 法測定時顏色會隨著時間的延長不斷加深，建議每次測定時都作標準曲線，且顯色反應的速度和溫度有關，所以除非精確控制顯色反應的時間和溫度，否則每次都做標準曲線。

7、如果沒酶標儀，也可用普通分光光度計測定，但應考慮根據比色皿的最小測定體積，應按比例適當加大 BCA 工作液的用量使總體積不小于最小檢測體積，樣品和標準品的用量亦相應按比例放大；使用分光光度計測定蛋白濃度時，可以測定的樣品數量可能會顯著減少，Lablead 建議把系列標準品用量增加至 100μl，BCA 工作液用量增加至 1ml。

8、為了加快 BCA 法測定蛋白濃度的速度可以適當加熱，但是切勿過熱，否則易失效。