LabpO Blunt快速連接試劑盒（帶T4 ligase）

產品貨號：P0101

儲存溫度：－20℃儲存，6個月內不影響使用效果。

產品介紹

零背景平末端快速連接試劑盒是一種先進的自sha基因陽性選擇克隆系統，可以高效克隆平末端 PCR 產物和任何具有平末端的DNA片段。該試劑盒對磷酸化或非磷酸化的DNA片段都有效。陽性選擇載體和插入片段連接僅需5分鐘即可獲得超過95%的陽性重組克隆。由具有校正活性的聚合酶（如：Pfu polymerase）擴增的平末端PCR產物可直接連入克隆載體。連接產物可直接轉化常用的大腸桿菌菌株。

試劑盒提供一個新穎的自sha基因陽性選擇克隆載體pZERO-Blunt。該載體含有致死的自sha基因（內含多克隆位點），當載體與片段連接成功，自sha基因無法正確表達，包含重組子的細胞可以正常生長；當載體與片段連接不成功，載體自連后自sha基因正確表達，包含自連空載體的細胞無法存活，即零背景。這種陽性篩選策略無需藍白斑篩選，極大地加速了克隆篩選進程。

為方便酶切作圖和插入片段基因操作，pZERO-Blunt克隆載體的多克隆位點兩側各包含一個BglII識別序列。此外，該載體含有T7啟動子，可用于體內或體外轉錄、插入片段測序等研究。

操作步驟

1.連接反應的準備：

平末端PCR產物或者酶切后平末端片段可以通過瓊脂糖凝膠電泳分離回收（使用長波紫外光

下切膠或者可見光透射切膠避免DNA損傷造成連接失敗）。與載體的摩爾比是3:1。

2.連接反應：

1) 在一個標準的10ul連接反應體系中，加入1ul 40ng pZERO-Blunt載體、X ul PCR產物(在通常狀況下，沒有必要對PCR產物進行精確定量，一般PCR產物與載體的摩爾比優化至1:1~10:1就可以得到良好結果，推薦3:1，見附錄)、5ul 2×Quick ligation Buffer 和0.9ul的T4 DNA Ligase，其余用滅菌水補足。

反應按以下體系進行：

一般最后加入T4 DNA Ligase。

2)22℃連接5-10分鐘（一般可在PCR儀器完成）。

通常推薦 22℃連接5-10分鐘 ，>3kb 長片段連接可以延長至30分鐘。不推薦超過30分鐘，超過可能降低轉化子數量。

3)冰上冷卻，然后轉化或貯存于-20℃。

3.轉化：

1)100ul感受態細胞，置于冰上，*解凍后輕撣幾次將細胞均勻懸浮。

2)加入4－5ul連接液(最多可全部加入，只要連接液體積不超過感受態細胞體積的1/10)，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。

3)42℃水浴熱激90秒。冰上放置2~3 分鐘。

4)加500ulLB 或者SOC 培養基(不含抗生素)，37℃ 150rpm 振蕩培養60分鐘。

5)將200ul細菌涂布在氨芐青mei素(100µg/ml)平板上。

涂布細菌的用量依連接的效率及感受態細胞的感受率而進行適當的調整，如果預計的克隆較少，可通過離心（4,000rpm，2分鐘）后吸除部分培養液，留下適量的培養基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于一個平板中（涂布剩余的菌液可以放4度保存，第2天如果轉化菌落數量少，可將剩余菌液全部涂一個新培養板)。

6)平板在37℃下正向放置 1小時以吸收過多的液體，然后倒置培養過夜。

4.轉化子的篩選鑒定：

1) 常規檢測：將得到的菌落接種1-5ml LB（含有終濃度為100µg/ml的氨芐青mei素）培養基，37℃搖床振蕩培養過夜，保存菌種后提取質粒，應用PCR或酶切方法鑒定插入片段是否正確。

2) 快速檢測：挑取菌落直接進行PCR檢測（可參見分子克隆第3版本）。

3) 測序鑒定：使用試劑盒自帶引物或者T7啟動子引物測序來確定是否含有目的克隆。

試劑盒自帶測序引物（暨菌落PCR引物）：

附錄：

如何計算連接反應中需要的PCR 產物的量 ?

一般PCR產物與載體的摩爾比優化至1:1~10:1（推薦3:1）就可以得到良好結果，可采用以下公式：

[加入載體的量（ng）×插入片段大小（kb）÷載體大小（kb）]×插入片段和載體的摩爾比=插入片段的量（ng） 例如：插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1，如連接反應中加入載體40ng，插入片段大小為500bp，這時應加入插入片段的量為[40ng載體×0.5kb插入片段÷2.974kb載體]×3/1=20.2ng。

pZERO-Blunt 載體圖譜:

pZERO-Blunt 載體克隆位點序列: